Biochemia to nauka zajmująca się substancjami o niebagatelnym znaczeniu dla żywych organizmów. Intrygujący jest fakt, że my sami jesteśmy wielkim laboratorium, w którym nieustannie toczą się setki procesów biochemicznych, zachodzą utlenianie i redukcja, kompleksowanie, hydroliza, rozpuszczanie i osmoza, a więc to, co znamy w większości jedynie z praktyki laboratoryjnej. Żeby lepiej poznać własny organizm i jego fizjologię zachęcam do wykonania kilku prostych doświadczeń z pogranicza chemii organicznej i biologii, a przy okazji zaznajomienia się z podstawami metod analizy stosowanej szeroko w medycynie. Odczynniki konieczne do przeprowadzenia oznaczeń nie są skomplikowane i w większości dla każdego dostępne. Zdobycie materiału zaś, będzie wprost trywialne i już na wstępie serdecznie namawiam do wyzbycia się ewentualnych "oporów" - plucie na chodnik jest w moim przekonaniu o wiele obrzydliwsze..

Soki trawienne

Na początku zajmiemy się grupą wydzielin określanej wspólnym mianem soków trawiennych. Oczywiście trawienie zaczyna się już w jamie ustnej, pod wpływem śliny.

Ślina

Ślina wytwarzana jest w ilości około 1 litra na dobę, przez zespół ślinianek i gruczołów w ustach i na języku. Ma lekko kwaśny odczyn, utrzymywany przez układy buforowe: H₂CO₃/NaHCO₃ oraz fosforany i białka. Zawiera wiele jonów nieorganicznych (Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Cl-, HCO₃-, H₂PO₄-, CNS-) i związków organicznych: glukozę, aminokwasy, mocznik, kwas moczowy, cholesterol, kreatyninę i białka (mucyna, albuminy, globuliny, amylaza ślinowa, fosfatazy, dehydrogenaza mleczanowa i aminotransferazy). Chlorki są niezbędne do działania amylazy (enzym hydrolizujący skrobię). Zmiana odczynu śliny na zasadowy jest przyczyną odkładania się kamienia nazębnego, gdyż rozpuszczalne pierwszo- i drugorzędowe fosforany przechodzą w nierozpuszczalny trzeciorzędowy ortofosforan. Głównym składnikiem kamienia nazębnego jest fosforan wapnia. Rodanek występujący w małych ilościach powstaje prawdopodobnie w wyniku detoksykacji kwasu cyjanowodorowego, a u ludzi palących jego ilość jest wielokrotnie większa (dym tytoniowy zawiera przecież ślady cyjanków)

Skupimy się na wykryciu podstawowych składników śliny.

Wykrywanie składników nieorganicznych śliny

Do 10cm³ śliny dodajemy kroplami 0,1M kwas octowy aż do wystąpienia zmętnienia. Po ogrzaniu roztwór przesączamy. W pozbawionym białek przesączu (próbki po 2cm³) wykrywamy:

• chlorki - rozc. HNO₃ + AgNO₃
• siarczany - rozc. HCl + BaCl₂
• fosforany - rozc. HNO₃ + molibdenian amonu
• wapń - rozc. HCl + szczawian amonu
• rodanki - rozc. HCl + FeCl₃ (powstaje czerwony rodanek żelazowy i fosforan żelaza, dlatego dodajemy HgCl₂ - strąca się biały rodanek rtęciowy)

Wytrącanie mucyn w ślinie

Mucyny wytrącają się pod wpływem rozcieńczonego roztworu kwasu octowego w postaci kłaczkowatego osadu.
Do 3cm³ śliny dodajemy kroplę 0,1M r-ru kwasu octowego.
Z (bio)chemicznego punktu widzenia mucyny to duże cząsteczki białkowe, których jedna z ciekawszych funkcji to utrzymywanie stałego napięcia powierzchniowego łez.


Białka śliny

Pod wpływem kwasu sulfosalicylowego wytrącają się albuminy i globuliny. Mucyna jako mukoproteina przechodzi do roztworu.
Do 2cm³ śliny dodajemy 2cm³ 7% r-ru kwasu sulfosalicylowego. Przesączamy. Na przesączu wykonujemy próbę biuretową (przypominam etymologię tej nazwy - biuret,  czyli dimocznik. Jeśli ktoś mówi "bjuret" to spokojnie i rzeczowo go uświadamiamy) - do przesączu dodajemy 10% r-r NaOH i kilka kropli 1% r-ru CuSO₄. Fioletowe zabarwienie świadczy o obecności białka w ślinie.

Oznaczeń na innych sokach trawiennych dokonywać nie będziemy.

Mocz

Badanie moczu należy do podstawowych badań analitycznych wykonywanych w laboratoriach klinicznych. Mocz jest produktem czynności nerek i zawiera prawie wszystkie końcowe produkty przemiany materii. W warunkach fizjologicznych przez nerki przepływa w ciągu 1 minuty ok. 1,2 litra krwi (tj. ok. 0,6 litra osocza), co stanowi 25% minutowej pojemności serca. W tej samej jednostce czasu powstaje z przepływającego osocza ok. 120cm³ przesączu kłębuszkowego, zwanego moczem pierwotnym, a  jego skład chemiczny jest taki sam jak skład osocza pozbawionego białka. W czasie przepływu moczu przez kanaliki nerkowe zachodzi cały szereg fizyko-chemicznych i biologicznych procesów wybiórczego wchłaniania zwrotnego, wydalania i wydzielania poszczególnych składników moczu ostatecznego, czynnego regulowania wydalania wody oraz stężenia jonów wodorowych.
, Z całości wytworzonego w ciągu doby moczu pierwotnego powstaje około 1-1,5 litra moczu ostatecznego. Rutynowo w badaniu najpierw ocenia się własności fizyczne i chemiczne, a na końcu osad.

Właściwości fizyczne moczu opisuje cały szereg własności: ilość dobowa, barwa, przejrzystość, woń, ciężar właściwy i odczyn. Postaram się pokrótce omówić każdą z nich, nie wdając się w poszczególne przypadki patologii (odchyleń związanych z chorobami).

W warunkach prawidłowych człowiek wydala z moczek ok. 60-80% przyjętych płynów. Z tego powodu bezwględna ilość wydalanego moczu nie jest należytym miernikiem zdolności wydzielniczej nerek (ważniejszy jest tzw. współczynnik wodny, tj. stosunek wydalonego w ciągu doby moczu do ilości wypitych płynów)

Mocz prawidłowy ma barwę jasnożółtą (słomkową), która zależy od barwników: urochromu (prawdopodobnie z przemiany tryptofanu) i urobiliny (redukcja bilirubiny daje bezbarwny urobilinogen, który utleniając się przechodzi w urobilinę. Bilirubina normalnie nie występuje w moczu, natomiast jeśli mocz ją zawiera to po pewnym czasie przybiera zabarwienie zielone, w wyniku utlenienia tego barwnika), jest przejrzysty, ma odczyn lekko kwaśny (pH 5,6-6,5)
Zapach jego jest charakterystyczny, aromatyczny. Co ciekawe, zmienia się po niektórych pokarmach (np. szparagi) albo lekach (witamina B1, mentol). Zawsze też można zabłysnąć w gronie koleżanek informując, że niedobór dekarboksylazy ketokwasów z rozgałęzionym łańcuchem węglowym powoduje zmianę zapachu moczu na przypominający syrop klonowy...

Bilirubina

Urobilina

Urobilinogen

 

Półilościowe oznaczanie cukru w moczu - próba Benedicta

To najbardziej czuła i specyficzna ze wszystkich prób redukcyjnych na cukry. Kreatynina ani kwas moczowy nie redukują odczynnika Benedicta (tak jak np. w przypadku próby Fehlinga). Czynnikiem wiążącym Cu(OH)₂ w rozpuszczalny kompleks jest tu cytrynian sodu.

Odczynnik: w 0,6dm³ wrzącej wody rozpuścić 173g cytrynianu sodu i 100g bezwodnego węglanu sodu. Po ochłodzeniu dodać powoli, stale mieszając, 0,1dm³ 17,3% roztworu CuSO₄, dopełnić wodą do 1dm³.
Oczywiście do naszych celów można przygotować mniej np. 0,1dm³ odczynnika (100ml), wtedy wszystkiego bierzemy odpowiednio mniej.

Do 5cm³ odczynnika dodajemy 10 kropli moczu, mieszami i wstawiamy do wrzącej wody na 5 minut. Po tym czasie wyjmujemy i oziębiamy probówkę pod bieżącą wodą. W przypadku obecności cukru w moczu (lub innym roztworze) powstaje żółty, pomarańczowy lub czerwony osad. Z jego barwy można w przybliżeniu ocenić stężenie cukru.

Barwa mieszaniny reakcyjnej	Przybliżona zawartość cukru w g/dm3
Bez zmian	0
Zielona, brak osadu	1-3
Zielona, osad	5
Żółtozielona	10
Pomarańczowa, osad	15
Czerwona, osad	20 i powyżej

Próba mureksydowa

Służy do wykrywania kwasu moczowego (a ogólnie puryny i jej pochodnych).
Badany mocz odparowujemy w parowniczce do sucha, dodając do pozostałości kilka kropel 6M roztworu kwasu azotowego.
Po ponownym odparowaniu nad palnikiem (wyciąg!) powstaje czerwony osad, przybierający po dodaniu roztworu amoniaku zabarwienie fioletowe.
Pod wpływem kwasu azotowego kwas moczowy utlenia się na kilka produktów (rysunek poniżej)
Dwie cząsteczki alloksanu (=alloksantyna) z amoniakiem tworzą kwas mureksydowy, który daje barwne sole z jonami NH⁴⁺ i Na⁺.

 

Wykrywanie kwasu acetylooctowego metodą Gerhardta

Mocz zawierający kwas acetylooctowy daje czerwone zabarwienie z roztworem FeCl₃.
Kilka cm³ moczu zadajemy 10% r-rem chlorku żelaza(III). Powstaje brunatny osad fosforanów żelaza(III). Po odsączeniu dodajemy ponownie kilka kropel roztworu. Ciemnoczerwone zabarwienie, znikające po kilkuminutowym gotowaniu świadczy o obecności kwasu acetylooctowego. Jego obecność powinna być objawem zastanawiającym - ciała ketonowe pojawiają się w moczu w cukrzycy, kwasicy cukrzycowej, w nieodpowiedniej diecie (wysokotłuszczowej) a także po długim głodzie (nasilony katabolizm tłuszczy i białek).

Wykrywanie urobiliny - próba Bogomołowa

Mimo tego, że najpierw powinniśmy wykryć urobilinogen metodą Ehrlicha, zastosujemy pewne przeinaczenie.
Przez wzgląd na to, że w oznaczeniu Ehrlicha użyć trzeba aldehydu dimetyloparaaminobenzoesowego (który bądź co bądź nie stoi u każdego w domu na półce) dodajemy do moczu niewielką ilość nadtlenku wodoru (albo rozcieńczonego kwasu azotowego) i bardzo energicznie wytrząsamy (np. w rozdzielaczu) otwierając co kilka sekund zawór, by powstały gaz uleciał. Teraz utleniony do urobiliny urobilinogen możemy wykryć tak:
do 10cm³ moczu dodajmy 0,5cm³ stężonego kwasu octwego i 0,5cm³ 20% roztworu siarczanu miedzi.
Mieszamy energicznie i wlewamy 1-2cm³ chloroformu. W razie obecności urobiliny warstwa chloroformowa barwi się na różowo.

Wykrywanie barwników żółciowych (próba Gmelina)

Przebieg próby jest prawie identyczny jak w przypadku odczynu Hellera.
Na ok. 2cm³ kwasu azotowego nawarstwiamy 12cm³ moczu. Występuje tęcza barw.
Jeszcze lepiej próbę przeprowadzić na bibule - w tym celu przesączamy kilkanaście cm³ moczu, sączek lekko podsuszamy i dotykamy bagietką szklaną z kroplą stężonego HNO₃ na końcu. Powstają barwne pierścienie. Zielony świadczy o obecnośc barwników żółciowych (bilirubina przechodzi w biliwerdynę)

Tym kolorowym oznaczeniem zakończymy analizy płynów ustrojowych.Wspomnę tylko, że istnieje jeszcze wiele metod, ale z konieczności operowania drogimi albo trującymi odczynnikami, bądź też spektrofotometrem nie opisywałem ich. Często są też one "nieefektowne", ale to czy wytrącanie się kłaczków jest efektowne czy nie, jest kwestią gustu.
A o gustach się nie dyskutuje.
Owocnych badań!