niedziela, 04 grudnia 2011 00:03

Oznaczanie zawarto艣ci bia艂ek

Oce艅 ten artyku艂
(0 g艂os贸w)

Bia艂ko - jest to naturalny polipeptyd, czyli polimer aminokwas贸w po艂膮czonych ze sob膮 wi膮zaniami peptydowymi. G艂贸wnymi pierwiastkami wchodz膮cymi w sk艂ad bia艂ek s膮 C, O, H, N, S, tak偶e P, oraz niekiedy jony Mn, Zn, Mg, Fe, Cu, Co i inne.

Zawarto艣膰 azotu w bia艂kach przeci臋tnie wynosi 16%, przy wahaniach od 15% do 18% w zale偶no艣ci od rodzaju i pochodzenia bia艂ka.

Metody oznaczania bia艂ek mo偶na podzieli膰 na:

Chemiczne:

  • Kjeldahla
  • Wolkera
  • Jakubowskiego

Fizyczne:

  • ekstrakcja (wymywanie glutenu)
  • spektrofotometria
  • kolorymetryczne


Ja skupie si臋 na metodzie Kjeldahla gdy偶 jest on najpopularniejsza. Na pocz膮tku przedstawi臋 wst臋pne wiadomo艣ci na temat tej metody, co na pewno u艂atwi zrozumienie dalszej cz臋艣ci i istoty tego oznaczenia.

 

Metoda Kjeldahla



Polega na mineralizacji pr贸bki, destylacji amoniaku (uwolniony amoniak wi膮偶e si臋 w odbieralniku z kwasem borowym w obecno艣ci wska藕nika Toshiro) i miareczkowanie uwolnionego amoniaku (mianowanym roztworem HCl) do zmiany barwy pH=4,3.
Oznaczona w ten spos贸b ilo艣膰 azotu przelicza si臋 odpowiednim mno偶nikiem na bia艂ka.



I Mineralizacja pr贸bki:


Mineralizacje pr贸bek przeprowadza si臋 鈥榥a mokro鈥 w Kwasie siarkowym(VI), w specjalnych kolbach Kjeldahla o kszta艂cie jajowatym, pod wyci膮giem ze wzgl臋du na 偶r膮cy charakter wydzielaj膮cych si臋 gaz贸w.
Wielko艣膰 pr贸bki pobranej do mineralizacji uzale偶nia si臋 od zawarto艣ci bia艂ka w badanym produkcie, przy czym za optymalna przyjmuje si臋 pr贸bk臋 zawieraj膮c膮 10-30mg azotu, czemu odpowiada 60-200mg czystego bia艂ka. Zwykle wielko艣膰 pr贸bek kszta艂tuje si臋 na poziomie 0,5-2g w przypadku materia艂贸w sta艂ych, do kilku a nawet kilkudziesi臋ciu cm3 w przypadku materia艂贸w ciek艂ych. Kwas siarkowy(VI) st臋偶ony (d=1,84g/dm3) dodaje si臋 zwykle w ilo艣ciach 10 lub 20cm3, zale偶nie od wielko艣ci pr贸bki pobieranej do spalania. Kwas siarkowy(VI) nie powinien zawiera膰 azotu. Dlatego celu uwzgl臋dniania tej ewentualno艣ci wykonuje si臋 tak zwan膮 pr贸b臋 艣lep膮, odczynnikow膮.
Przed rozpocz臋ciem mineralizacji do kolby dodaje si臋 katalizatory, np.: rt臋ciowe (Hg, HgO), miedziowe (Cu, CuO, CuSO47middot;5H2O) lub selenowe (CuSeO3路2H2O), a ponadto substancje podnosz膮ce temperatur臋 wrzenia (K2SO4).
Dzia艂anie katalityczne wymienionych substancji sprowadza si臋 do przenoszenia tlenu z kwasu siarkowego(VI) na substancj臋 organiczn膮, co przebiega zgodnie z reakcjami:

Hg + H2SO4 ---> HgO + SO2 + H2O
4HgO ---> 2Hg2O + O2
Hg2O ---> HgO + Hg
4CuO ---> 2Cu2O + O2
Cu2O + H2SO4 ---> 2CuO + SO2 + H2O


W przypadku stosowania rt臋ci jako katalizatora niezb臋dne jest dodanie sproszkowanego cynku przed destylacj膮, gdy偶 rt臋膰 daje zwi膮zki z amoniakiem, kt贸re nie rozk艂adaj膮 si臋 pod wp艂ywem mocnych zasad, a wod贸r In statu nascendi powoduje rozk艂ad tych po艂膮cze艅, z uwolnieniem siarczanu(VI) amonu.
Po wprowadzeniu do kolby pr贸bki badanego materia艂u, Kwasu siarkowego oraz katalizatora przyst臋puje si臋 do 艂agodnego ogrzewania zawarto艣ci kolby palnikiem gazowym. W pocz膮tkowym okresie ogrzewania zawarto艣膰 kolby pieni si臋 i ciemnieje w tym czasie ogrzewanie nale偶y prowadzi膰 bardzo ostro偶nie, a nawet z przerwami, aby nie dopu艣ci膰, aby czarnobrunatna masa wychodzi艂a do szyjki kolby. Gdy zawarto艣膰 kolby, przestanie pulsowa膰 i podnosi膰 si臋, wylot kolby zamyka si臋 szklan膮 ch艂odniczk膮, nape艂nia wod膮, kt贸rej celem jest ograniczenie parowania kwasu. Nast臋pnie wzmaga si臋 ogrzewanie, a gdy zawarto艣膰 kolby staje si臋 p艂ynna, a nast臋pnie przezroczysta, przerywa si臋 ogrzewanie na kilka minut i po och艂odzeniu sp艂ukuje si臋 resztki zw臋glonej masy za pomoc膮 kilku cm3 wody destylowanej. Po osi膮gni臋ciu pe艂nej klarowno艣ci p艂ynu w kolbie, kt贸rego zabarwienie zale偶y od rodzaju u偶ytego katalizatora (miedz daje barw臋 niebieska), kontynuuje si臋 ogrzewanie jeszcze w czasie 20-30min i nast臋pnie ch艂odzi si臋 zawarto艣膰 kolby i przyst臋puje do destylacji amoniaku.
Reakcje przebiegaj膮ce podczas mineralizacji:


1. Rozk艂ad kwasu siarkowego (VI) z uwolnieniem tlenu:


2H2SO4 ---> 2SO2 +O2 +2H2O


2. Utlenianie substancji organicznych, w tym r贸wnie偶 zwi膮zk贸w azotowych, z uwolnieniem dwutlenku w臋gla, wody i amoniaku:



3. Ulatnianie si臋 dwutlenku w臋gla i wody, (co wyst臋puje w czasie ogrzewania) oraz przechodzenie amoniaku w siarczan(VI) amonu:



2 NH3 + H2SO4 ---> (NH4)2SO4



II Destylacja amoniaku:


Do destylacji amoniaku najlepiej jest stosowa膰 aparat, Parnasa-Wagnera. Zmineralizowan膮 pr贸bk臋 lub jej okre艣lon膮 cze艣膰 przenosi si臋 przez lejek do aparatu, pop艂ukuj膮c wod膮 destylowan膮, a ko艅c贸wk臋 odprowadzaj膮c膮 skropliny z ch艂odnicy zanurza si臋 do kolby sto偶kowej z nasyconym, ok. 4% roztworem kwasy borowego, pobranym w ilo艣ci 40cm3. Zamiast kwasu borowego mo偶e by膰 stosowana 艣ci艣le odmierzona obj臋to艣膰 mianowanego roztworu kwasu solnego. Do roztworu kwasu w kolbie sto偶kowej dodaje si臋 kilka kropli wska藕nika, kt贸rym mo偶e by膰 wska藕nik Toshiro (mieszanina czerwieni metylowej i b艂臋kitu metylenowego w alkoholowym roztworze) lub wska藕nik Ma Zuazaga (mieszanina czerwieni metylowej i zieleni bromokrzemowej w alkoholowym roztworze), po czym przez lejek wprowadza si臋 kilka kropli 1% alkoholowego roztworu fenoloftaleiny, a nast臋pnie ok. 40% roztw贸r NaOH, do chwili uzyskania r贸偶owego zabarwienia roztworu w kolbie. Ilo艣膰 roztworu zasady mo偶e by膰 wyliczona r贸wnowagowo na podstawie ilo艣ci kwasu, jak膮 wprowadzono ze zmineralizowan膮 pr贸bk膮 z niewielkim nadmiarem, w celu uzyskania alkaicznego odczynu 艣rodowiska. Po alkalizowaniu roztworu zamyka si臋 kran 艂膮cz膮cy lejek z reszt膮 aparatury i przyst臋puje do destylacji amoniaku, przepuszczaj膮c par臋 wodna z kolby. Destylacj臋 prowadzi si臋 w czasie 10-15 min, po czym sprawdza si臋, czy amoniak zosta艂 w pe艂ni oddestylowany, nanosz膮c sp艂ywaj膮ca krople cieczy z konik贸wki na czerwony papierek lakmusowy. Zmiana barwy papierka na jasnoniebieski 艣wiadczy o nieca艂kowitym oddestylowaniu amoniaku, a brak zmiany zabarwienia papierka lakmusowego dowodzi, 偶e proces destylacji amoniaku zosta艂 zako艅czony. Po zako艅czeniu destylacji ko艅c贸wk臋 ch艂odnicy sp艂ukuje si臋 woda destylowan膮 i Kolbe sto偶kow膮 wraz z zawarto艣ci膮 odstawia do miareczkowania.



S - lejek z kranem; C - kolba destylacyjna; A - kolba destylacyjna (wytwornica pary); P - kolba sto偶kowa; D - ch艂odnica; B - odprowadzenie pr贸bki do kana艂u po zako艅czeniu destylacji amoniaku.
Reakcje przebiegaj膮ce podczas destylacji amoniaku:


1. Alkalizacja 艣rodowiska i wydzielanie si臋 amoniaku



H2SO4 + 2NaOH ---> Na2SO4 + 2H2O
(NH4)2SO4 + 2NaOH ---> Na2SO4 + 2H2O + 2NH3



2. Destylacja amoniaku i jego zoboj臋tnianie w roztworze kwasu borowego lub solnego:



H3BO3 + NH4OH ---> NH4H2BO3 + H2O
HCl +NH4OH ---> NH4Cl + H2O



III Miareczkowanie:

 

Zawarto艣膰 kolby sto偶kowej, do kt贸rej destylowano amoniak, miareczkuje si臋 mianowanym roztworem HCl, w przypadku stosowania kwasu borowego, lub te偶 mianowanym roztworem NaOH odmiareczkowuje si臋 nadmiar kwasu solnego (siarkowego), pobranego przed destylacj膮. Miareczkowanie mianowanym roztworem HCl w obecno艣ci wska藕nika Toshiro prowadzi si臋 do chwili przej艣cia barwy zielonej w fioletow膮, a w obecno艣ci wska藕nika Ma Zuazaga do chwili przej艣cia barwy zielonej w r贸偶ow膮. W ten sam spos贸b post臋puje si臋 z pr贸b膮 艣lep膮, odczynnikow膮, kt贸r膮 mineralizowano przy u偶yciu tych samych odczynnik贸w i w tych samych ilo艣ciach jak w przypadku pr贸by w艂a艣ciwej, z tym, 偶e bez pr贸bki badanego materia艂u.
Na podstawie wynik贸w miareczkowania oblicza si臋 zawarto艣膰 azotu w badanym materiale:





X - liczba gram贸w azotu odpowiadaj膮ca 100g (cm3) badanego produktu
V - liczba cm3 mianowanego roztworu HCl o st臋偶eniu ok. 0,1mol/dm3, zu偶yta do miareczkowania w pr贸bie w艂a艣ciwej.
V1 - liczba cm3 mianowanego roztworu HCl o st臋偶eniu ok. 0,1mol/dm3 zu偶yta do miareczkowania w pr贸bie 艣lepej.
Cmk - dok艂adne st臋偶enie molowe roztworu HCl, u偶ytego do miareczkowania.
m - liczba gram贸w (cm3) badanego produktu pobrana do mineralizacji, a nast臋pnie destylacji.
0,01401 鈥 liczba gram贸w azotu odpowiadaj膮ca 1 milimolowi HCl lub 1cm3 roztworu HCl o st臋偶eniu 艣ci艣le 1mola/dm3.

W przypadku destylacji amoniaku do okre艣lonej obj臋to艣ci mianowanego roztworu HCl, a nast臋pnie odmiareczkowania nadmiaru tego kwasu za pomoc膮 mianowanego roztworu NaOH, ilo艣膰 azotu oblicz si臋 wed艂ug nast臋puj膮cego wzoru:





X - liczba gram贸w azotu odpowiadaj膮ca 100g (cm3) badanego produktu (% masowy)
V - liczba cm3 mianowanego roztworu HCl o st臋偶eniu ok. 0,1mol/dm3, pobrana do odbieralnika przed destylacj膮 amoniaku.
V2 鈥 liczba cm3 mianowanego roztworu NaOH o st臋偶eniu ok. 0,1 mol/dm3, zuzyta do odmiareczkowania nadmiaru HCl w pr贸bie 艣lepej.
Cmk - dok艂adne st臋偶enie molowe roztworu HCl pobranego do odbieralnika przed destylacj膮 amoniaku.
Cmz - dok艂adne st臋偶enie molowe roztworu NaOH uzytego do odmiareczkowania nadmiaru HCl.
m - liczba gram贸w (cm3) badanego produktu pobrana do mineralizacji, a nast臋pnie destylacji.
0,01401 鈥 liczba gram贸w azotu odpowiadaj膮ca 1 milimolowi HCl lub 1cm3 roztworu HCl o st臋偶eniu 艣ci艣le 1mola/dm3.

Obliczon膮 ilo艣膰 azotu przelicza si臋 nast臋pnie na bia艂ko, mno偶膮c przez wsp贸艂czynnik przeliczeniowy 6,25 (100 :16 przy czym 10 oznacza procentowa zawarto艣膰 azotu w bia艂ku), czyli wsp贸艂czynnik zale偶y od rodzaju bia艂ka jakby kto艣 si臋 nie domy艣li艂.

Opisane na podstawie w艂asnych notatek , zmodyfikowana definicja bia艂ka z wielkopedi.

 

Artyku艂 napisa艂:
Delta


Czytany 8314 razy Ostatnio zmieniany 艣roda, 07 grudnia 2011 21:25
Zaloguj si臋, by skomentowa膰